菌落总数和大肠菌群检测步骤

一、菌落总数检验

菌落总数，是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后（如培养基成分、培养温度、培养时间、pH 值、需氧性质等），1g（1mL）检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长的嗜中温的需氧性和兼性厌氧菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行卫生学总评价的综合依据。

操作步骤如下 ：

1. 用灭菌吸管吸取 1：10 稀释的检液 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。另 取 1mL 注入到 9mL 灭菌生理盐水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成 1:100 检液。吸取 2mL，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成 1:1000，1:10000，……等，每个稀释度应换 1 支吸管。

2. 将融化并冷至 45℃—50℃的卵磷脂吐温 80 营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约15mL，随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约 15mL 卵磷脂吐温 80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置 36℃±1℃培养箱内培养 48h±2h，为空白对照。

3. 为便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每 100mL 卵磷脂吐温 80 营养琼脂中加入 1mL 0.5%的 TTC 溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。

菌落计数方法

先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用 5 倍—10 倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以 2，以代表全皿菌落数。

菌落计数及报告方法

1. 首先选取平均菌落数在 30—300 之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个 稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数报告之（见表 1 中例 1）。

2. 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30—300之间， 则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小于或等于 2，应报告其平均数，若大于 2 则以其中稀释度较低的平皿的菌 落数报告之（见表 1 中例 2 及例 3）。

3. 若所有稀释度的平均菌落数均大于 300，则应按稀释度**的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例 4）。

4. 若所有稀释度的平均菌落数均小于 30，则应按稀释度**的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1 例 5）。

5. 若所有稀释度的平均菌落数均不在 30—300 之间，其中一个稀释度大于 300，而相邻的另一稀释度小于 30 时，则以接近 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1中例 6）。

6. 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每 g 或每 mL 小于 10CFU。

7. 菌落计数的报告，菌落数在 10 以内时，按实有数值报告之，大于 100 时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用 10 的指数来表示（见表 1 报告方式栏）。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。

8.按重量取样的样品以 CFU/g 为单位报告；按体积取样的样品以 CFU/mL 为单位报告。

二、耐热大肠菌群检验

耐热大肠杆菌群系需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌，在 44.5℃培养 24h—48h 能发酵乳糖产酸并产气。 该菌主要来自人和温血动物粪便，可作为粪便污染指标来评价化妆品的卫生质量, 推断化妆品中有否污染肠道致病菌的可能。

操作步骤如下：

1. 取 10mL 1：10 稀释的检液，加到 10mL 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基中，置 44.5℃±0.5℃培养箱中培养 24h，如既不产酸也不产气，继续培养至 48h，如仍既不产酸也不产气，则报告为耐热大肠菌群阴性。

2. 如产酸产气，划线接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36℃±1℃培养18h—24h。同时取该培养液 1—2 滴接种到蛋白胨水中，置 44.5℃±0.5℃培养 24h±2h。 经培养后，在上述平板上观察有无典型菌落生长。耐热大肠菌群在伊红美蓝琼脂培养基上的典型菌落呈深紫黑色，圆形，边缘整齐，表面光滑湿润，常具有金属光泽。也有的呈紫黑色，不带或略带金属光泽，或粉紫色，中心较深的菌落，亦常为耐热大肠菌群，应注意挑选。

3. 挑取上述可疑菌落，涂片作革兰氏染色镜检。

4. 在蛋白胨水培养液中，加入靛基质试剂约 0.5mL，观察靛基质反应。阳性者液面呈玫瑰红色；阴性反应液面呈试剂本色。

检验结果报告

根据发酵乳糖产酸产气，平板上有典型菌落，并经证实为革兰氏阴性短杆菌，靛基质试验阳性，则可报告被检样品中检出耐热大肠菌群。